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Indagine molecolare e sierologica dei pazienti infetti da 2019-nCoV: implicazione di vie di dispersione multiple

Introduzione

I Coronavirus (CoV) appartengono alla sottofamiglia Orthocoronavirinae della famiglia dei Coronaviridae e all’ordine dei Nidovirales. Un coronavirus umano (SARS-CoV) ha causato l’epidemia di coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave (SARS) nel 2003. Più recentemente, un CoV correlato alla SARS è stato implicato come agente eziologico responsabile dell’epidemia a Wuhan, nella Cina centrale. Si stima che l’epidemia sia iniziata il 12 dicembre 2019 e che 17.332 casi confermati in laboratorio con 361 decessi al 3 febbraio 2020 in Cina [1]. Il virus si è diffuso in altri 23 Paesi da viaggiatori provenienti da Wuhan [1]. I sintomi tipici sono febbre, malessere, mancanza di respiro e, nei casi più gravi, polmonite [2-4]. La malattia è stata chiamata prima polmonite virale non identificata.

Abbiamo rapidamente identificato l’agente eziologico, denominato 2019-nCoV (nome del virus designato dall’Organizzazione Mondiale della Sanità). Il virus appena identificato è un virus correlato alla SARS (SARSr-CoV) ma condivide solo il 74,5% dell’identità del genoma con la SARS-CoV [2]. Abbiamo sviluppato strumenti di rilevamento molecolare basati su geni di spike virali. I nostri studi precedenti indicano che il metodo qPCR può essere utilizzato per il rilevamento del 2019-nCoV in tamponi orali o nel liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) [5]. Inoltre, abbiamo sviluppato metodi di rilevamento IgM e IgG utilizzando una proteina nucleocapside cross-reattiva (NP) da un altro SARSr-CoV Rp3 [6], che è identica al 92% al 2019-nCoV NP. Utilizzando questi strumenti sierologici, dimostriamo un aumento dei titoli anticorpali virali nei pazienti infettati con 2019-nCoV [5].

Come la SARS-CoV, 2019-nCoV ha indotto la polmonite attraverso le vie respiratorie attraverso l’osservazione clinica. Pertanto, la presenza di antigene virale nei tamponi orali è stata utilizzata come standard di rilevamento per il 2019-nCoV. Analogamente, due volte di tamponi orali negativi in un intervallo di 24 ore sono stati considerati ufficialmente dai pazienti come clearance virale. Qui abbiamo avviato un’indagine sul 2019-nCoV in un ospedale di Wuhan, con l’obiettivo di indagare l’altra possibile via di trasmissione di questo virus.

Materiali e metodi

Raccolta del campione

Campioni umani, compresi tamponi orali, tamponi anali e campioni di sangue sono stati raccolti dall’ospedale polmonare di Wuhan con il consenso di tutti i pazienti e approvati dal comitato etico dell’ospedale designato per le malattie infettive emergenti. Sono state effettuate due indagini. Nella prima indagine, abbiamo raccolto campioni da 39 pazienti, 7 dei quali erano in gravi condizioni. Nella seconda indagine, abbiamo raccolto campioni da 139 pazienti, ma le loro cartelle cliniche non erano disponibili. Abbiamo mostrato solo pazienti che erano positivi al rilevamento di nucleotidi virali. I pazienti sono stati campionati senza preferenze di sesso o di età, a meno che non fosse indicato. Per i tamponi, in ogni provetta è stato aggiunto 1.5 ml DMEM+2% di terreno FBS. Supernatante è stato raccolto dopo 2500 rpm, 60 s vortex e 15-30 min in piedi. Supernatante da tamponi sono stati aggiunti al tampone di lisi per l’estrazione dell’RNA. Il siero è stato separato mediante centrifugazione a 3000 g per 15 min all’interno di 24 h di raccolta, seguito da 56°C 30 min inattivazione, e poi conservato a 4°C fino all’uso.

Estrazione dell’RNA e qRT-PCR

Ogni volta che sono stati utilizzati kit commerciali, le istruzioni del produttore sono state seguite senza modifiche. L’RNA è stato estratto da 200 μl di campioni con l’High Pure Viral RNA Kit (Roche). L’RNA è stato eluito in 50 μl di buffer di eluizione e utilizzato come modello per RT-PCR. Metodo di rilevamento QPCR basato sul gene 2019-nCoV S può essere trovato nello studio precedente [5]. In breve, l’RNA estratto da sopra utilizzato in qPCR da HiScript® II One Step qRT-PCR SYBR® Green Kit (Vazyme Biotech Co., Ltd). La miscela di reazione qPCR da 20 μl conteneva 10 μl 2× One Step SYBR Green Mix, 1 μl One Step SYBR Green Enzyme Mix, 0,4 μl 50 × ROX Reference Dye 1, 0,4 μl di ogni primer (10 μM) e 2 μl di template RNA. L’amplificazione è stata eseguita come segue: 50°C per 3 min, 95°C per 30 s seguita da 40 cicli composti da 95°C per 10 s, 60°C per 30 s, e un passo di curva di fusione predefinito in una macchina ABI 7500.

Test sierologico

I kit ELISA interni anti-SARSr-CoV IgG e IgM sono stati sviluppati utilizzando come antigene il SARSr-CoV Rp3 NP, che ha condiviso oltre il 90% di identità aminoacidica con tutti i SARSr-CoV, come riportato in precedenza [5]. Per il test IgG, le piastre ELISA MaxiSorp Nunc-immuno 96 pozzetti sono state rivestite per una notte con NP ricombinante. I sieri umani sono stati utilizzati a diluizione 1:20 per 1 h a 37°C. È stato usato un anticorpo monoclonale anti-IgGG-HRP umano coniugato con anticorpo monoclonale (Kyab Biotech Co., Ltd, Wuhan, Cina) ad una diluizione di 1:40.000. È stato calcolato il valore di DO (450-630). Per il test IgM, le piastre MaxiSorp Nunc-immuno 96 wellELISA sono state rivestite per una notte con IgM antiumane (catena µ). I sieri umani sono stati utilizzati alla diluizione 1:100 per 40 min a 37°C, seguiti da anti-Rp3 NP-HRP coniugati (Kyab Biotech Co., Ltd, Wuhan, Cina) ad una diluizione di 1:4000. È stato calcolato il valore di DO (450-630).

Risultati

Nella prima indagine, abbiamo cercato di verificare se il virus positivo può essere trovato nel tampone anale e nel sangue, così come nei tamponi orali. Abbiamo condotto un’indagine molecolare sui pazienti dell’ospedale polmonare di Wuhan, che al momento del ricovero sono risultati positivi al 2019-nCoV come tamponi orali. Abbiamo raccolto sangue, tamponi orali e tamponi anali per il test qPCR 2019-nCoV utilizzando il metodo precedentemente stabilito [5].

Abbiamo trovato 15 pazienti che sono ancora portatori di virus dopo giorni di trattamenti medici. Di questi pazienti, 8 erano positivi al tampone orale (53,3%), 4 erano positivi al tampone anale (26,7%), 6 positivi al sangue (40%) e 3 positivi al siero (20%). Due pazienti sono risultati positivi sia per il tampone orale che per quello anale, ma nessuno dei tamponi positivi al sangue è risultato positivo anche per il tampone. Non sorprende che tutti i sieri positivi siano risultati positivi anche per il siero intero (Tabella 1). In sintesi, il nucleotide virale può essere trovato nel tampone anale o nel sangue anche se non può essere rilevato nei tamponi orali. Va notato che, sebbene i tamponi possano essere negativi, il paziente potrebbe comunque essere viremico.Tabella 1. Rilevazione molecolare del 2019-nCoV in tamponi e sangue. I campioni sono stati prelevati da tamponi orali (OS), anali (AS) e sangue. I dati sono stati mostrati come valori Ct qPCR. Sono stati mostrati pazienti in gravi condizioni durante l’indagine. OSAS Sangue interoSerumMalattia gravePaziente 133,5 NoPaziente 2 30.324,3SìPaziente 330,3 NoPaziente 4 32,1 NoPaziente 5 33,1 NoPaziente 6 30.6 NoPaziente 732.730.2 NoPaziente 8 33.1 NoPaziente 9 31.434.5 NoPaziente 10 30.933.0SiPaziente 1127.3 NoPaziente 1234.4 SìPaziente 1332.933.6 NoPaziente 1432.3 NoPaziente 15 31.6 No

Abbiamo poi fatto un’altra indagine per scoprire i cambiamenti dinamici della presenza virale in due studi consecutivi in tamponi sia orali che anali in un altro gruppo di pazienti. I pazienti target erano quelli che hanno ricevuto circa 10 giorni di trattamenti medici al momento del ricovero. Abbiamo testato sia i livelli di anticorpi virali che i livelli di nucleotidi virali con il metodo precedentemente stabilito [5]. Abbiamo dimostrato che entrambi i titoli IgM e IgG erano relativamente bassi o non rilevabili nel giorno 0 (il giorno del primo campionamento). Il giorno 5, un aumento degli anticorpi virali può essere visto in quasi tutti i pazienti, che è stato normalmente considerato come una transizione dal periodo di infezione precedente a quello successivo (Figura 1 e tabella supplementare 1). La percentuale di IgM positivi è aumentata dal 50% (8/16) all’81% (13/16), mentre la percentuale di IgG positivi è aumentata dall’81% (13/16) al 100% (16/16). Questo è in contrasto con un tasso relativamente basso di rilevazione positiva dal test molecolare (sotto).Figura 1.Rilevazione sierologica del 2019-nCoV. La linea tratteggiata indica il taglio, che è stato determinato in base ai dati dei controlli sani.

Per la rilevazione molecolare, abbiamo trovato 8 tamponi orali positivi (50%) e 4 tamponi anali (25%) in queste 16 persone il giorno 0. Il giorno 5, siamo stati in grado di trovare solo 4 tamponi orali positivi (25%). Al contrario, abbiamo trovato 6 tamponi anali positivi (37,5%). Contando tutti i tamponi positivi insieme, abbiamo trovato che la maggior parte dei positivi proviene dal tampone orale (8/10, 80%) del giorno 0. Tuttavia, questa tendenza sembra cambiare il giorno 5. Abbiamo trovato più (6/8, 75%) tamponi anali positivi rispetto a quelli orali (4/8, 50%). Un’altra osservazione è la ricomparsa del virus in 6 pazienti che sono stati rilevati negativi il giorno 0. Da notare che 4 di questi 6 positivi al virus provenivano da tamponi anali (Tabella 2). Questi dati suggeriscono un passaggio da una maggiore positività orale durante il periodo iniziale (come indicato dai titoli anticorpali) a una maggiore positività anale durante il periodo successivo.Tabella 2.Rilevazione molecolare del 2019-nCoV in tamponi da due indagini. I campioni sono stati prelevati da tamponi orali (OS), anali (AS) e sangue. I dati sono stati mostrati come valori Ct qPCR. Data 0-OSDate 0-ASDate 0-ASDate 5-ASDate 5-ASPatiente 1 23.2 Paziente 230.3 Paziente 3 19,5 Paziente 432.730,2 Paziente 5 33,1 Paziente 631,1 30.031,4 Paziente 727.3 Paziente 8 27,0 Paziente 932,933,6 Paziente 10 23,8 Paziente 1131,9 Paziente 1232.3 Paziente 13 17,8Paziente 14 25,5Paziente 15 30,0Paziente 1633,8 26,927,5

Discussione

Entro 1 mese dall’insorgenza della malattia 2019-nCoV, abbiamo rapidamente sviluppato strumenti di rilevamento molecolare e sierologico. Questo è il primo studio molecolare e sierologico su questo virus dopo l’identificazione iniziale del 2019-NCoV su 7 pazienti con diagnosi di polmonite virale non identificata [5]. Abbiamo rilevato il virus in tamponi orali, tamponi anali e sangue, quindi i pazienti infetti possono potenzialmente liberarsi di questo agente patogeno attraverso vie respiratorie, fecali-orali o fluidi corporei. Inoltre, abbiamo applicato con successo il test sierologico su una vasta popolazione e abbiamo mostrato che potrebbe migliorare notevolmente il tasso di rilevamento positivo.

Dimostriamo che l’attuale strategia per la rilevazione dell’RNA virale nei tamponi orali usati per la diagnosi del 2019-nCoV non è perfetta. Il virus può essere presente nei tamponi anali o nel sangue dei pazienti quando il rilevamento dei tamponi orali è negativo. Nei pazienti con infezione da SARS-CoV e MERS-CoV, l’infezione intestinale è stata osservata in fasi successive dell’infezione [7-9]. Tuttavia, i pazienti infettati con 2019-nCoV possono ospitare il virus nell’intestino allo stadio precoce o tardivo della malattia. Vale anche la pena di notare che nessuno dei pazienti affetti da viremia aveva tamponi positivi. Questi pazienti sarebbero probabilmente considerati negativi al 2019-nCoV attraverso la sorveglianza di routine, e quindi costituirebbero una minaccia per le altre persone. Al contrario, abbiamo trovato anticorpi virali in quasi tutti i pazienti, indicando che la sierologia dovrebbe essere considerata per l’epidemiologia 2019-nCoV. Si può osservare un possibile passaggio da positivo per via orale durante l’infezione precoce a positivo per tampone anale durante l’infezione tardiva. Questa osservazione implica che non possiamo dimettere un paziente solo sulla base dei tamponi orali negativi, che potrebbe ancora liberarsi del virus per via orale-fecale. Soprattutto, suggeriamo vivamente di utilizzare i test sierologici IgM e IgG virali per confermare un’infezione, considerando i risultati inattendibili del rilevamento dei tamponi orali.

In sintesi, forniamo un’avvertenza che il 2019-nCoV può essere trasmesso attraverso molteplici vie. Sono necessari sia test molecolari che sierologici per confermare definitivamente un vettore del virus.

Materiale supplementare

Fonte

Zhang W, Du R, Li B, Zheng X, Yang X, et al. (2020) Molecular and serological investigation of 2019-nCoV infected patients: implication of multiple shedding routes. Emerging Microbes & Infections 9(1): . https://doi.org/10.1080/22221751.2020.1729071